Hallo,

heute geht es schon einmal etwas um das sterile Arbeiten, aber zuvor zeige ich euch die Folterwerkzeuge. Nicht alles ist unbedingt notwendig, manches wird man vielleicht auch erst später anschaffen, wenn man weiß, dass dieses Hobby wirklich Spaß machen wird.

Es muss auch jeder seine eigene Arbeitstechnik entwickeln. So wie ich hier meine Technik zeige, ist sie im Laufe der letzten vier Jahre entstanden, und das heißt nicht, dass man es nur so machen kann. Aber ich habe damit für mich zufriedenstellende Ergebnisse erzielt und weiß, dass es so sehr gut geht.

Ich säe heute grundsätzlich in Reagenzgläser aus. Sie haben den Vorteil, dass je Glas nur wenig Nährboden benötigt wird - 5 bis 6 ml - und somit kann man viele Gläser füllen, dabei die Zutaten variieren und auch bei jedem Arbeitsgang in mehrere Gläser aussäen.

Ich verwende die Reagenzgläser der Maße 16 x 160 mm mit Bördelrand:



Es gibt noch Gläser ca. 14 x 130 mm ohne Bördelrand, die habe ich versehentlich einmal im Internet gekauft, nutze die aber nur im Notfall, weil man die Gläser nur durch den Bördelrand sicher verschließen kann. Also die nachstehenden nicht kaufen:



Als nächstes brauche ich eine Waage. Das ist zum einen für größere Mengen, z.B. Wasser, eine normale Küchenwaage, aber für kleine Mengen bis ca. 30 g brauche ich eine Feinwaage, wie es sie jetzt günstig im Internet zu kaufen gibt. Meine ist ja nicht mehr ganz neu, es gibt jetzt bessere, mít meiner kann man die zweite Stelle hinter dem Komma ablesen, d.h. 10 mg. Das heißt aber nicht, dass man damit 10 mg abwiegen kann, die Genauigkeit reicht dafür nicht aus. Aber zum Abmessen von 6 g Agar oder 15 g Zucker oder 2 g Aktivkohle ist sie genau richtig:



Dazu gibt es ein Eichgewicht von 25 g, mit dem man die Waage von Zeit zu Zeit eichen kann. Man merkt aber gleich, dass die Werte immer etwas hin- und herlaufen.



Die Waage kann prinzipiell 50 g abwiegen, aber man muss darauf achten, dass das Messgefäß leicht ist, sonst bekommt man zu oft Fehlermeldungen. Ich benutze einen PP-Becher aus meiner Fotosammlung:



Wenn ich wirklich exakt wägen will, dann benutze ich eine Analysenwaage, die ich mir mal günstig und gebraucht im Internet gekauft habe. Auf dieser Waage messe ich die Stoffe für die Nährböden ab, insbesondere auch die Spurenelemente, Pflanzenhormone und Vitamine für die Stammlösungen. Sie stammt ungefähr aus dem Jahre 1985, ist aber in ihrer Funktion wie neu. Ich kann damit einigermaßen sicher 1 mg abwiegen, die Anzeige ist dabei 0,1 mg:



Flüssigkeiten messe ich entweder bei größeren Mengen mit einem Messzylinder, sehr gern aber auch mit medizinischen Spritzen, wie ihr sie in der Apotheke bekommt. Ich habe da Insulinspritzen mit 1 ml, unterteilt in 40 Skalenteile, d.h. 5 Skalenteile - und weiter sollte man nicht gehen - entsprechen 0,125 ml. Diese Spritze empfiehlt sich insbesondere bei der Dosierung von Hormonen, bei denen ja nur 0,2 bzw. 0,5 mg pro Liter Nährboden zugegeben werden.

Dann habe ich noch Spritzen mit 2 ml, mit 5 ml und die oft gebrauchten grünen mit 10ml. Die mit 10 ml setze ich insbesondere beim Absaugen von Kondenswasser oder Resten an Bleichflüssigkeit aus den Gläsern ein. Außerdem dosiere ich damit den gerade gekochten flüssigen Nährboden in die Reagenzgläser. Eine Spritze von 50 ml benutze ich zur Dosierung von noch flüssigem Nährböden in Rundgläser zum Umlegen. Spritzen sind in der Apotheke sehr preisgünstig, allerdings müsst ihr den Apotheker davon überzeugen, dass ihr keine Junkies seid :



Wichtig sind auch die richtigen Kanülen. Ich benutze Kanülen mit den Maßen 0,9 x 40 mm.

Flüssigkeiten kann man auch gut mit einer Messpipette dosieren. Wenn die Flüssigkeiten Chemikalien sind, sollte man nicht mit dem Mund ansaugen sondern einen sog. Peleusball verwenden. Ich habe ihn noch aus dem Studium. Man kann daran sehen, dass Gummi auch nach Jahrzehnten nicht spröde werden muss, wenn die Qualität gut ist:



Als nächstes zeige ich euch die Folterinstrumente - im Gegensatz zum Mittelalter ist alles aus Edelstahl:



Ganz links die etwas grobe Pinzette verwende ich zum Herausziehen der Wattestopfen aus den Reagenzgläsern. Die nächsten beiden Pinzetten sind zum Hantieren mit Protokormen und Sämlingen gedacht. Die rechte ist eine Pinzette aus dem Elektroniklabor, ziemlich teuer und schon mehr als 30 Jahre alt. Die linke habe ich kürzlich im Dutzend zu je 1,50 EUR gekauft, sie ist etwas klobig, erfüllt aber alle Anforderungen. Wichtig ist, dass die Enden flach sind und nicht spitz. Ihr wollt doch eure Protokorme nicht erstechen!

Dann kommen zwei Mikrospatel. Der linke wird mit dem rechteckigen Ende zur Aussaat verwendet, d.h. die Samen werden damit aus dem Bleichröhrchen heraus gekratzt und in die Gläser transportiert und dort in den Nährboden etwas eingedrückt. Der rechte dient mit der kleinen Schaufel zum Dosieren von Symbiosepilz-Agar, um damit weitere Gläser zu infizieren - kriegen wir später. Zur Not kann man mit dem rechteckigen Ende auch die Samen dosieren, aber dieses Ende ist im Vergleich zum anderen Spatel ziemlich dick, was das Herauskratzen der Samen etwas schwierig gestaltet. Aber wenn einem der sterile andere einmal herunter fällt, dann ist man froh, wenn man noch einen sterilen Löffelspatel hat.

Dann kommt ein Skalpell, wobei Klinge und Halter hier getrennt sind. Ein Skalpell benötigt man zur Grünaussaat, bei der nur die noch grüne Samenkapsel von außen desinfiziert und dann zerschnitten wird. Ein scharfes Messer ohne Halter ginge auch, aber Skalpelle sind sehr scharf und gar nicht teuer.

Ja, ganz rechts kommt dann ein Spatel, von dem ich nicht mehr weiß, woher ich den habe. Er ist ideal geeignet, den mit Sämlingen besetzten Nährbodenpfropfen aus dem Reagenzglas herauszuziehen, damit man die Protokorme oder Sämlinge in andere Gläser umlegen kann. Notfalls kann man eine dickere Stricknadel an einem Ende mit einem Hammer platt klopfen und etwas umlegen.

Da die Werkzeuge steril sein müssen, habe ich nach einigem Nachdenken ein primitives Verfahren entwickelt, bei dem man erkennen kann, was man vor sich hat. Früher hatte ich alle Geräte in Alufolie eingewickelt sterilisiert, aber dann wusste ich oft nicht, was darin eingepackt war. Heute stecke ich die Geräte einzeln in Reagenzgläser, verschließe sie mit einem Stück Alufolie und sterilisiere sie. Nur der große Spatel passt nicht in eine Reagenzglas:



Ihr seht, das dabei keine Spritzen sind. Das Problem, die Spritzen sind zwar aus Polypropylen und somit sterilisierbar, aber sie leiern nach 2- oder 3-maligem Sterilisieren aus und sind dann nicht mehr dicht. Diese grünen Spritzen lege ich in Mikrozid AF ein, das ist ein Gemisch aus 25% Ethanol, 35% 1-Propanol und 40% Wasser. Wahrscheinlich kann man aber auch Brennspiritus nehmen, der auf 70% verdünnt ist. In ein normales Marmeladenglas passen 4 Spritzen mit den 4 Stempeln:



Die Kanülen dagegen kann man ganz normal im Reagenzglas sterilisieren:



Was brauchen wir noch? Mehrere kleinere Bechergläser:



Die werden wie üblich mit Alufolie überzogen sterilisiert, eine völlige Einhüllung in Folie ist nicht notwendig:



Frischhaltefolie und Alufolie, da gibt es unterschiedliche Qualitäten und Preise. Hier gilt wieder einmal nicht: Gut und teuer, nein die billigen sind besser. Ich hole mir die Folien bei Rossmann:



Wenn wir den Nährboden kochen, müssen wir den pH-Wert messen. Einfach geht das mit dem sog. pH-Papier, das man in Streifen oder Rollen kaufen kann. Genauer ist es mit einem pH-Meter, bei dem eine sog. Glaselektrode den pH-Wert misst. Das Gerät von Fa. Greisinger hat die Möglichkeit einer Temperatureinstellung, d.h. man kann auch noch in der Siedehitze messen. Das ist für unsere Fälle günstig, weil sich z.B. der Agar erst in der Siedehitze löst:



Ich habe den Eindruck, dass der pH-Wert des Nährbodens, den man in der Siedehitze misst, sich nach dem Abkühlen immer etwas nach oben verschiebt. Ideal für die meisten Böden ist ein pH-Wert von 5,7.

Diese Glaselektrode muss in einer Lösung von ca. 20 g Kaliumchlorid in 100 ml Wasser gelagert werden, dann hält sie viele Jahre lang:



Ich bleiche die Samen in PP-Röhrchen mit 5 ml Volumen und Verschlusskappe:



Sie stammen ursprünglich von Fa. Neolab, allerdings habe ich diese Röhrchen dort nicht mehr im Sortiment gefunden. Wichtig ist, dass der Übergang in der Öffnung glatt ist, damit man die Samen gut herauskratzen kann. Ich sterilisiere diese Röhrchen auch, nicht so sehr damit sie selbst steril sind, sondern eher, um zu verhindern, dass einzelne Samen von der vorherigen Benutzung hängen bleiben und mir z.B. bei seltenen Arten Keimung vorgaukeln, und in Wirklichkeit war es nur eine Dactylorhiza maculata. Ein Orchideenfreund nennt so etwas - glaube ich - "Sterilisationsmutanten".

Zum Bleichen benutze ich normalerweise eine 0,5%ige Lösung von DanKlorix. Wichtig ist, dass es die blaue Flasche ist:



Es gibt noch eine grüne Flasche, die enthält aber noch Tenside und ist für unsere Zwecke nicht geeignet. Der Wirkstoff ist Natriumhypochlorit - NaOCl, der 2,8%ig vorliegt:



Wenn man eine Bleichlösung ansetzen will, muss man ja von 2,8% auf 0,5% verdünnen. Hier ist ein Beispiel, das man dann beliebig nach dem Dreisatz umrechnen kann:

9 ml DanKlorix und 41 ml dest. Wasser = 50 ml 0,5%ige Bleichlösung.

Hier ist noch eine Anzahl von Umlegegläsern in verschiedenen Größen:



Die ganz großen Gläser verwende ich für die Anzucht mit Symbiosepilzen auf verschiedenen Substraten. Bei den kleineren handelt es sich um Gläser für asymbiotische Kulturen. Bei einigen dieser Gläser seht ihr in der Mitte des Deckels ein kleines Loch. Das wird mit einem halben Wattestopfen verschlossen und soll die Belüftung der Sämlinge sicherstellen. Es gibt ein anderes Verfahren, aber dazu muss ich mir erst einmal das ok holen, ob ich das hier beschreiben darf.

Da wir noch bei den Geräten sind, hier ist ein idealer Drucktopf zum Sterilisieren:



Es ist ein Sicomatic mit rechnerisch 6,8 Liter Volumen, der zwar neu recht teuer ist, den man aber häufig auf Auktionen günstig kaufen kann. Der beim Sterilisieren durch den Dampfdruck heraustretende Stift hat zwei Markierungsringe. Richtig ist das Sterilisieren, wenn der zweite Ring sichtbar ist, dann herrschen im Topf Temperaturen von etwa 118 Grad Celsius.

Man füllt etwa 3 bis 4 cm Wasser ein und stellt die zu sterilisierenden Geräte auf den Einsatz, so dass diese nicht im Wasser stehen. Der Topf wird mit dem Deckel verschlossen, aber man lässt das Ventil, das man am Griff kontrollieren kann, noch offen. Man erhitzt zunächst mit höchster Stufe des Herdes und bei geöffnetem Ventil so lange, bis ca. eine Minute lang nasser Dampf austritt - man fühlt das mit der vorgehaltenen Hand. Zunächst muss nämlich die Luft aus dem Topf entfernt werden, sonst kommt man nicht auf die notwendige Temperatur. Wenn sich der Dampfstrom dann richtig nass anfühlt wird das Ventil geschlossen, der Herd herunter geregelt, so dass der zweite Ring sichtbar wird. Dann überlässt man das Ganze 30 min sich selbst. Danach wird der Topf vom Herd genommen und auskühlen gelassen. Auf keinen Fall den Dampf ablassen, wenn z.B. Nährboden sterilisiert wurde würde dieser im Topf aufkochen und überschäumen. Erst wenn der Stift wieder eingezogen ist kann man den Topf öffnen.

Ich würde euch empfehlen als Wasser für den Topf dieses übliche sog. destillierte = demineralisierte zu nehmen. Für diesen Tipp habe ich schon Hohn und Spott bezogen, aber bei ständiger Verwendung von Leitungswasser im Topf wird euch der Mechanismus in Griff und Ventil allmählich verkalken. Ich vermute, dass dies durch Spritzer verursacht wird; denn wenn das Wasser nur immer nachgefüllt wird, konzentriert es sich ja allmählich an Calcium und Magnesium auf.

In dem abgebildeten Topf kann man z.B. ca. 50 Reagenzgläser mit Nährboden gleichzeitig sterilisieren, indem man jeweils 12 - 13 Gläser in 4 Honiggläser einstellt. Diese Technik soll aber erst im nächsten Teil beschrieben werden, da ich dazu erst einmal wieder viele Fotos machen muss.

Ein Wort zum Backofen, der ja oft als Alternative zum Sicomatic erwähnt wird. Ich habe das nie gemacht, weil ich schon zu Beginn einen Drucktopf hatte. Es ist wohl möglich, die Gefahr des Überschäumens der Nährböden ist bei zu heißer Einstellung zu beachten, wie gesagt, Erfahrungen habe ich damit nicht. Allerdings bekommt man im Nährboden nie die zur richtigen Sterilisierung notwendigen 118 Grad, man erreicht drucklos lediglich 100 Grad, egal wie heiß man den Herd einstellt.

Ehe ich beim nächsten Mal auf die Zubereitung des ersten Nährbodens eingehe, hier noch die Abbildung einer Sterilbank:



Diese Sterilbank ist weitgehend nach der Anleitung von Thomas Ederer von mir gebaut worden, Kosten ca. 300 EUR. Oben filtert eine Matte die Luft vor, im oberen Teil sitzt auch das Gebläse, das die Luft durch das senkrecht stehende Hepafilter drückt. Der vordere Reinraum hat etwa die Maße (Breite, Tiefe, Höhe) von 70 x 50 x 40 cm. Sichtbar ist eine Plexiglasscheibe, die in zwei Rasten verstellbar ist. Die untere Einstellung ist für das empfindlichere asymbiotische Arbeiten, die obere für das Arbeiten mit Symbiosepilzen. Die Scheibe verhindert das Bilden einer Luftwalze, durch die unreine Falschluft eingezogen werden könnte.

Die melaminbeschichteten Platten sind 16 mm stark, Thomas Ederer hatte 19 mm empfohlen. Allerdings hat die Bank schon bei 16 mm-Platten über 40 kg Gewicht. Ich habe das Konzept noch etwas abgewandelt, klemme das Hepafilter nicht an sondern klebe es mit Silikon ein und habe eine senkrecht durchgehende Platte, die nur die Öffnung für das dann eingeklebte Filter hat. Damit stelle ich absolut sicher, dass keine unreine Falschluft von der Druckseite in den Reinraum geraten kann.

Zum heutigen Schluss noch kurz ein Wort zum sterilen Arbeiten. Das Innere des Reinraums ist ja zunächst nicht steril. Ich habe zu Beginn die Bank mit Brennspiritus zur Desinfektion ausgewischt. Dann habe ich Mikrozid AF zum Auswischen verwendet. Das war schon besser. Da ich auf den Geruch des Alkohols allergisch reagierte, habe ich schließlich etwas ganz Anderes ausprobiert, und ich wische die Bank heute vor Gebrauch mit 0,5%igem Natriumhypochlorit aus, d.h. mit auf 0,5% eingestelltem DanKlorix, dem ich ein paar Tropfen Spülmittel zusetze. Am besten, man lässt dann in dem Zimmer eine Zeitlang das Fenster offen und tut in dieser Zeit etwas anderes. Der Geruch ist anfangs etwas störend, aber er verfliegt auch schnell.

Auf dieses Thema gehe ich noch weiter ein, wenn ich die genauen Arbeitsvorgänge beschreibe. Für heute ist nun erst einmal Schluss. Ihr müsst euch ja auch erst einmal etwas erholen.

Viele Grüße
Claus

Hallo Achim,

ich habe Dir wegen der Waage eine PM geschickt.

Ich schaue jetzt schon ein paar Tage und war bislang bei einem Modell mit einem Bereich bis 300 g und einer Ablesung von 0,01 g, das immerhin brutto knapp 200,00 € inkl. Versand kosten soll,- und das ist schon günstig, wenn man sieht, was da sonst so angeboten wird. Nur im Ablesebereich 0,1 g habe ich ein Modell für rd. 70,00 € gefunden. Bei ibäh sind zwar noch billigere, aber die schauen schon nach den Fotos echt merkwürdig aus.

Ein sehr nettes Mitglied hat mir u.a. zwei Gläschen geschickt, in denen schon Protokorme sind. Guck hier:





Auf die Gefahr hin, dass ich erneut zu weit vorpresche, dazu sofort wieder eine Frage:

Mir erscheinen diese kleinen, nur ca. 5cm hohen Gläschen mit Gummikappenverschluss viel praktischer, als solch hohe Reagenzgläser, aus denen man dann später mit Mühe vom Grund wieder die gekeimten Samen herausfischen muss, um sie umzulegen.

Da ich als sicher davon ausgehe, dass Claus diese kleinen Gläschen auch kennt, wird er wohl einen Grund haben, sie nicht zu benutzen. Dieser Grund liegt worin?

Zitat von Wolfgang

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Mir erscheinen diese kleinen, nur ca. 5 cm hohen Gläschen mit Gummikappenverschluss viel praktischer, als solch hohe Reagenzgläser, aus denen man dann später mit Mühe vom Grund wieder die gekeimten Samen herausfischen muss, um sie umzulegen.

Da ich als sicher davon ausgehe, dass Claus diese kleinen Gläschen auch kennt, wird er wohl einen Grund haben, sie nicht zu benutzen. Dieser Grund liegt worin?

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Hallo Wolfgang,
oben hatte ich ja schon einige Gründe angegeben: "Ich säe heute grundsätzlich in Reagenzgläser aus. Sie haben den Vorteil, dass je Glas nur wenig Nährboden benötigt wird - 5 bis 6 ml - und somit kann man viele Gläser füllen, dabei die Zutaten variieren und auch bei jedem Arbeitsgang in mehrere Gläser aussäen."

Ein wesentlicher weiterer Grund ist die Möglichkeit, mit einer guten Lupe (10x) die Samen auf dem Nährboden im Reagenzglas sehr gut beobachten zu können. Du siehst wie die Embryonen anschwellen, wie die Testa platzt, wie sich erste Rhizoide bilden, alle Entwicklungsstufen kann man sehr gut verfolgen. Das ist in Rundgläsern nur am Rand möglich, man kann also nie die Gesamtmenge der Samen auf ihre Entwicklung überblicken.

Wenn man in luftdicht verschlossene Gläser aussät, kann man die Sämlinge nicht allzu lange auf dem Nährboden lassen, da ein gewisser Sauerstoffbedarf gedeckt sein muss. Meine Versuche zeigten, dass in solchen Gläsern nach etwa 3-4 Monaten die Sämlinge begannen abzusterben. Man muss sie also mehrmals umlegen. Die von dir gezeigten sind ja auch noch nicht reif zum Auspikieren.

Ein für mich nicht gut nachvollziehbarer Grund ist die Tatsache, dass die Keimung in diesen Rundgläsern bei mir immer schlechter war als in Reagenzgläsern. Ich kann nur vermuten, dass es daran liegt, dass man die Samen in den Nährboden im Reagenzglas besser eindrücken kann. Er sollte aber auch nicht im Nährboden untertauchen.


Zum Umlegen fischt man die Protokorme oder Sämlinge nicht heraus, sondern man zieht mit einem speziellen Spatel - habe ich oben auch gezeigt - den ganzen Nährbodenwurm heraus und pickt die Sämlinge mit einer Pinzette auf. Wenn man so einen Spatel nicht hat, dann muss man sich ein geeignetes Werkzeug bauen, z.B. aus einer platt geklopften dickeren Stricknadel.


Viele Grüße
Claus

Zitat von Claus

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...Wenn man in luftdicht verschlossene Gläser aussät, kann man die Sämlinge nicht allzu lange auf dem Nährboden lassen, da ein gewisser Sauerstoffbedarf gedeckt sein muss. Meine Versuche zeigten, dass in solchen Gläsern nach etwa 3-4 Monaten die Sämlinge begannen abzusterben. Man muss sie also mehrmals umlegen. ...

Ein für mich nicht gut nachvollziehbarer Grund ist die Tatsache, dass die Keimung in diesen Rundgläsern bei mir immer schlechter war als in Reagenzgläsern. ...

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Das sind gleich zwei Gründe, die für die höheren Reagenzgläser sprechen. Danke für die Antwort, Claus.

Hallo,

bisher habe ich mit unbelüfteten Gläsern keine Probleme gehabt. Auf meinem Einheitsnährboden (derzeit Sigma P6668 in halber Konzentration + Zucker + Kokos) keimen die Samen oder sie lassen es. Beispielsweise Pl.bifolia und Himantoglossum hirc. sind erst nach 11 Monaten! gekeimt, dann auch nur wenige. Ich lasse sie bis ca 6 Wochen nach der Keimung im Aussaatglas. Dann nehme ich sie mit einer spitzen Pinzette und lege sie auf frische Böden um. Wenn die Entwicklung gut läuft, kommen sie nach weiteren 6 Wochen auf den 3. und letzten Nährboden. Danach pikiere ich in Neudohum. Der Aussaatboden darf ruhig ein wenig weicher sein. Bei mir keimen verschiedenste Arten im Boden und auf der Oberfläche. Es mag sich aber insgesamt um eher "einfache" spezies handeln: Oph.fuciflora, Oph sphegodes, div. Dactylorhiza, Gymnadenia conopsea, Orchis militaris...

Letztlich muss man einen für die gegebenen Möglichkeiten geeigneten Stil entwickeln. Ich hab früher auch mal Wattestopfen verwendet, hat bei mir leider nicht so gut geklappt. Die Gummistopfen und kleinen Gläschen bevorzuge ich, da ich über Dampf arbeite. Dort ist es besser einzelne Protokorme mit der Pinzette auf den neuen Nährboden zu legen. Ich habe keine Ablage für die gesamte Operfläche des Aussaatröhrchens. Den Gummistopfen schmieß ich ins sprudelnde Wasser und fische/piekse ihn anschließend mit einer spitzen Pinzette wieder raus. Der verzicht auf Belüftung entstand übrigens frei nach murphy´s gesetz: "komplizierte Arbeiten überlasse dem faulsten - der findet den einfachsten weg"

@Rudolf: ich bin auch erst kurz (gute 2 Jahre) wieder dabei und hoffe auf erste blüten aus eigener Aussaat im kommenden Frühjahr. Inzwischen muss ich sagen, der aufwand lohnt sich. Bin von TGZ abgekommen, obwohl der für Dacty, morio etc. auch geeignet ist und ich davon auch noch Reste habe. Sogar coriophora ist darauf gekeimt. Der Närhboden war > 10 Jahre alt und nicht im Kühlschrank gelagert.

Gruß Jürgen